飞凡检测脊髓灰质炎病毒灭活试验 病毒灭活 消毒剂病毒灭活试验
试验目的：
用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中脊髓灰质炎的量。以细
胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对脊髓灰质炎的灭活率。
准备：
1、试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作
用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。
2、阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试
验和培养，观察脊髓灰质炎生长是否良好。
3、阴性对照组。用不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污
染，细胞是否生长良好。
方法：
脊髓灰质炎悬液定量灭活试验方法
试验步骤：
1、从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两
次后，转种于加有10ml完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，
用于消毒试验。
2、取出低温冻存的脊髓灰质炎-1毒株，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后
接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察
病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破
碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管1.0ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，
冷冻保存于-80℃备用。
3、取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中备用。
4、取100µl有机干扰物质与100µl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml
待检消毒剂，立即混匀并记时。作用规定时间，立即取出0.1ml，加入中和剂中混匀；或用
经鉴定合格的除药方法处理。
5、阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂。
6、各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行。
7、试验重复3次。
8、终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后在96
孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔（各孔中应该已经长满单
层的宿主细胞），在37℃，放置1h～2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板，
更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO 2 ）培养，逐日在显微镜
下观察细胞病变，连续观察3d，逐孔观察并记录细胞病变情况。
终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量（TCID 50 ）表示。
9、噬斑法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后接种于细
胞培养瓶中，滴定各稀释度样本中残留的病毒量。
接种细胞前，将生长致密的单层细胞中的培养液倾出，加入1ml 待测样品，放置37℃吸
符1h～2h，倾出样液，加入含0.8%琼脂的细胞维持液3ml，冷却后翻转细胞瓶，放置37℃
培养48h～72h。然后每瓶细胞加入2ml 甲醛溶液固定数分钟，用自来水冲洗后加结晶紫
溶液染色数分钟，冲洗干净后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区即为一个蚀斑单位，每毫
升测试样品中的病毒含量计算：
pfu/ml＝平板平均蚀斑数×稀释倍数
注意：为了便于计数，病毒蚀斑数一般控制在每细胞瓶10pfu～30pfu。
数据分析:
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID 50 或pfu）
的为N 0 ，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID 50 或pfu）为Nx。
平均灭活对数值= log No－log Nx
在正常情况下，3次试验的平均灭活对数值≥4.00，可判为对脊髓灰质炎病毒污染物消
毒的实验室试验合格。同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在5～7 之间.