飞凡检测张同学带您了解检测慢病毒插入位点的测序文库构建方法和慢病毒插入位点检测方法与流程
1.本发明涉及基因分析检测技术领域，尤其涉及一种检测慢病毒插入位点的测序文库构建方法和慢病毒插入位点检测方法。
飞凡检测背景技术：
2.基因治疗是一种治疗遗传病和其他恶性疾病的有效手段，在重症地中海贫血及血液病的治疗中已进行临床应用。慢病毒载体是基因治疗中常用到的运输载体，但是慢病毒由于具备随机整合入宿主基因组的特性，随机插入可能会失活抑癌基因或激活原癌基因表达，导致癌变的风险。在临床前研究及临床应用中，评估慢病毒插入位点及相关的安全性是必须要进行的一项工作和研究内容。仔细研究病毒插入区域及其在单克隆中的分布，是非常必要和重要的。美国fda要求在基因治疗中检测所有的病毒插入位点。
3.对慢病毒随机插入的评估方法随着基因治疗的应用发展而发展。以往的研究中，人们最早利用southern杂交和前病毒pcr的方法进行病毒插入位点变异数的鉴定，该方法的问题是灵敏度和特异性不够。尤其是病毒基因产生的插入突变，具有激活原癌基因或者抑制抑癌基因的表达等潜在风险。二十世纪90年代利用限制性内切酶，人们发明了反向pcr及splinkerettepcr，第一次检测到病毒基因组插入的侧翼序列。但是反向pcr的灵敏性较低，最多检测出40个插入位点，并且不能对体内较为复杂的样本进行详细分析。线性扩增pcr(lam-pcr)的发现是病毒插入位点的一个主要的进步，现有的病毒插入位点分析(vis)多基于该方法。lam-pcr可以用来检测复杂样品如来源于外周血的罕见的插入位点，但是该方法需要考虑到限制性内切酶的切割识别频率具有一定的偏好性，会引入技术上的误差，实验周期很长且需要大量的单克隆测序。随之，人们发明了各种优化限制性内切酶导致的内在的误差的技术，随着测序技术的发展，lam-pcr的克隆数据与测序技术结合，成为一种进行插入位点鉴定的有效方法。
4.现在很多病毒插入位点检测方法大部分是在lam-pcr的基础上，结合测序技术进行改进的，主要是利用生物素标记已知区域，富集插入位点的方法。但由于生物素亲和层析的结合效率低，要求的模板起始量比较高，比较难应用于临床前或者临床中的样本。并且生物素标记靶标区域作为引物，也增加了合成成本与工作时间。
飞凡检测技术实现要素：
5.本发明提供一种检测慢病毒插入位点的测序文库构建方法和慢病毒插入位点检测方法，具有快速、简单、成本低、起始量少、可分析方面多等特点。
6.根据本发明的第一方面，本发明提供一种检测慢病毒插入位点的测序文库构建方法，包括：
7.提供从慢病毒感染的细胞中提取的基因组dna，该基因组dna上包括至少一个待检测的慢病毒插入位点；
8.对上述基因组dna进行片段化，并将上述片段化的基因组dna处理成适于接头连接的形式；
9.在上述适于接头连接的片段化基因组dna的两端连接上不对称双链接头，得到接头连接产物，上述不对称双链接头包括长链序列和短链序列，其中上述长链序列从5’端至3’端依次包括固定序列、随机umi序列和扩增引物结合序列，上述短链序列包括与上述固定序列互补的序列；
10.对上述接头连接产物进行第一轮pcr扩增，其中上述第一轮pcr扩增的引物包括正向引物和反向引物，上述正向引物包括插入到上述细胞的基因组上的一段慢病毒序列或与其互补的序列，上述反向引物包括与上述长链序列的扩增引物结合序列互补的序列；
11.对上述第一轮pcr扩增的产物进行第二轮pcr扩增，其中上述第二轮pcr扩增的引物包括正向引物和反向引物，上述正向引物从5’端至3’端依次包括5’端磷酸化基团、测序平台正向固定序列和慢病毒序列或与该慢病毒序列互补的序列，该正向引物的结合位点位于上述第一轮pcr扩增的正向引物的结合位点的下游，上述反向引物从5’端至3’端依次包括测序平台反向固定序列和与上述长链序列的扩增引物结合序列互补的序列；
12.任选地，对上述第二轮pcr扩增的产物进行环化，得到适于上机测序的环化测序文库。
13.在优选实施例中，上述将上述片段化的基因组dna处理成适于接头连接的形式，包括：对上述片段化的基因组dna进行末端修复和加a尾碱基。
14.在优选实施例中，上述随机umi序列是10个碱基的序列nnnnnnnnnn，其中，每个n表示a、g、c、t四种碱基中的任意一种。
15.在优选实施例中，上述慢病毒序列是慢病毒的ltr区域的序列。
16.在优选实施例中，上述第一轮pcr扩增的正向引物和第二轮pcr扩增的正向引物的结合位点均位于慢病毒的ltr区域内且靠近与基因组相邻的位置。
17.在优选实施例中，上述基因组dna的起始量是50ng以上，优选50ng～1μg，更优选100ng～500ng。
18.在优选实施例中，上述第二轮pcr扩增的反向引物还包括：用于区分样本来源的条形码序列，该条形码序列位于与上述长链序列的扩增引物结合序列互补的序列的上游。
19.根据本发明的第二方面，本发明提供一种基因组dna上的慢病毒插入位点检测方法，包括：
20.提供一种通过第一方面的方法得到的测序文库；
21.对上述测序文库进行上机测序，得到测序数据；
22.对上述测序数据进行分析，得到基因组dna上的慢病毒插入位点情况。
23.在优选实施例中，上述慢病毒插入位点情况包括插入位点在染色体中的分布、插入位点在基因组中不同区域的分布以及插入位点在肿瘤基因中的分布中的一种或多种。
24.在优选实施例中，上述上机测序通过bgi-seq测序平台进行。
25.本发明的检测慢病毒插入位点的测序文库构建方法，模板起始量只需要50ng，不需要进行生物素标记化，减少合成成本和纯化成本，同时减少了生物素杂交捕获的时间，节省时间，避免限制性内切酶的切割，减少了限制性内切酶切割频率过程中的误差；通过随机序列的引入，可以更好地平衡测序数据，去除和合并重复序列，可以用于体内分化后的复杂
细胞的位点追踪，数据更可靠和准确。本发明具有操作简单、实验时间短、成本低、起始量少、通量高、可分析方面多等特点，可以更好地进行基因治疗中病毒插入位点的准确分析与评估。