货号 PH9143
名称 彗星法DNA损伤检测试剂盒 / DNA Damage Assay kit
规格 20T
存储 Store at 4℃
组分
Components 20 Assay Storage
Lysis Bufffer 100 mL 4℃
DMSO 8 mL 4℃
正常熔点琼脂糖 NMA 30mg 4℃
低熔点琼脂糖 LMA 30mg 4℃
Propidium Iodide （PI） 400ul 4℃避光
自备试剂和仪器
低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和 45℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microube、0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）缓冲液、PBS
产品简介
DNA 在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破环，磷酸二脂键的断裂，碱基的破环或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使 DNA 分子解旋。将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA 分子向阳极移动。如果 DNA 损伤严重，碎片多，则电泳速度快。未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。用 PI 染色或银染，可观察到 DNA 受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。
使用参考
1、细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为 1x10 6 个/mL；
2 、铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用 PBS 配制：
第 1 层凝胶的制备：将载玻片的磨砂面向上，45℃预热，将预热 45℃的 100μL的 0.5% 正常熔点琼脂糖（NMA）铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置 4℃下 10min使NMA凝固。
第 2 层凝胶的制备：将 10μL细胞（约 10 4 个）和 75μL的 0.7%低溶点琼脂糖LMA（在 37℃下水浴加热至少 20min 使之完全溶化）混合均匀。然后，轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的 LMA 滴到第 1 层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置 4℃10min 使第2 层 LMA 凝固。
第 3 层凝胶的制备：第 2 层LMA凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加预热 37℃的75μL的 0.7%低溶点琼脂糖LMA，如上盖上盖玻片 4℃下凝固（第三层覆盖第二层周围0.5mm,增加凝胶化作用时间至 30min，高湿度环境）。
3 、细胞裂解 移去盖玻片，将玻片置于平皿中，倒入预冷的 Lysis Bufffer（使用前每 9mL加入 1mL 的 DMSO），4℃裂解 1~2h，取出载玻片用 PBS 漂洗。
4 、DNA 碱解旋 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液（用户自备1mmol/L EDTA，300mmol/L NaOH），约覆过载玻片胶面 0.25cm 左右，室温放置 20~60min,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。
5 、单细胞电泳 在电压 25V，电泳 20~30min，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。
6 、中和与染色 电泳后将载玻片置于平皿内。加入 0.4mmol/LTris-HCl（ph7.5）缓冲液，将载玻片没入，4℃中和三次，每次 10min，弃去 Tris-HCl 缓冲液，每载玻片加 20μL 的PI 染液或 EB 染液，盖上盖玻片，避光染色 10min。
7 、观察、拍照和分析 荧光显微镜 515~560nm 波长的激发光、PI 染色的 DNA 图象呈红色，EB 染色的 DNA 图象呈桔红色，可清楚地观察到核 DNA 和迁移的 DNA（即慧星尾）。每个样本随机选择 100 个细胞，测定核 DNA 直径和 DNA 迁移的长度，可并用相应的软
件分析。
DNA 损伤按慧星尾部 DNA 量占全部 DNA 量的比例分为 5 级：
0 级： ＜ 5% 无损伤；
1 级 5 ~ 20% 轻度损伤；
2 级 20 ~ 40% 中度损伤；
3 级 40 ~ 95% 高度损伤；
4 级 ＞ 95% 重度损伤。
注意事项
Propidium Iodide（PI）和 EB 有毒，操作时要戴手套。
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