产品名称：Toneclone无缝克隆试剂盒
英文名称：Toneker Fast-Fusion Cloning Kit
产品规格：
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产品编号 |
产品规格 |
产品价格 |
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TK01143 |
10次/盒 |
￥400 |
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TK01145 |
50次/盒 |
￥900 |
产品组成：
1、Fast-Fusion Enzyme
2、10× Fast-Fusion Buffer
产品简介：
Toneclone无缝克隆试剂盒基于DNA序列同源性进行片段重组，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～21 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在Fast-Fusion Enzyme的催化下，最快仅需反应5 min，即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。
产品特点：
1、操作简便：无需考虑酶切点限制；
2、快速重组：15min实现载体和片段的快速重组；
3、效率更高：重组效率为传统酶切连接技术的5-10倍，无载体自连现象，阳性克隆可达90%以上。
产品应用：
1、PCR产物克隆进载体
2、基因转移
3、在插入片段前后插入adaptor、linker和标签
4、高通量克隆
实验方案
B．制备线性化载体
环形载体需要经过线性化处理，使载体待重组区域暴露出来，以供与插入片段进行重组拼接。线性化的方法可以通过限制性内切酶酶切或PCR方法实现。若采用酶切进行线性化处理，推荐进行琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收，以尽量避免为切割载体在转化后造成假阳性结果。若PCR扩增得到线性化载体，推荐使用高保真聚合酶进行扩增，减少PCR体系中的模板用量以减少初始质粒造成的假阳性，并在PCR结束后对产物进行切胶回收或使用DpnI酶消化残余质粒模板。
C. 插入片段的PCR引物设计
为了实现同源重组，插入片段扩增产物5’和3’末端需要带有和线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列（15−21 bp）。下图以pUC19作为克隆载体为例，设计引物：
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Forward Primer → |
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Vecor pUC19 Clone site |
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AATTC ACT GGC CGT CGT TTT ACA ACG-3’ |
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3’-ACG GAC GTC CAG CTG AGA TCT CCTAG |
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Gene-specific Primer EcoRI 15 bp tract (R) |
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← Reverse Primer |
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D. 插入片段的PCR扩增
插入片段可选用任何DNA聚合酶进行扩增，Taq DNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用Taq DNA聚合酶，产物末端的A尾在重组过程中将会被去除，不会因此产生单碱基插入突变。推荐使用高保真酶进行扩增，以减少在插入片段中引入突变。请在PCR完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认获得单一条带的DNA片段。可切胶回收以除去模板、引物、引物二聚体。可通过与已知的DNA分子量marker比较，确定得到的DNA量。
E．重组反应体系的建立以及反应条件
在冰水浴中，配制如下反应体系，将缓冲、水、线性化载体、插入片段加入PCR管中，轻弹混匀，最后加入酶。
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组成成分 |
用量 |
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10× Fast-Fusion Buffer |
1 μl |
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线性化载体 |
20−100 ng |
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插入片段 |
10−100 ng |
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ddH2O |
补加至10 μl |
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Fast-Fusion Enzyme |
1 μl * |
最适线性化克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，可由下列公式粗略计算获得：
Ø 线性化载体 = [0.01 × 线性化载体长度 (bp)] ng
Ø 插入片段 = [0.01 × 插入片段长度 (bp)] ng
例如将长度500 bp的插入片段克隆到长度2.7 kb的pUC19中，克隆载体的最适使用量为：0.01×2700=27 ng，插入片段的最适使用量为：0.02×500=10 ng。
注意：1. 当插入片段大于克隆载体时，两者计算用量公式应互换。
2. 线性化载体用量应在20−100 ng之间，插入片段扩增产物用量应在10−100 ng之间。当使用上述公式计算DNA用量超出这个范围是，请直接选择最低/最高使用量即可。例如插入片段200 bp，最适用量计算值为4 ng，实际反应体系中应加入10 ng。
反应体系配制完成后，轻弹混匀，并通过短暂离心使其沉到管底，立即放入已预热的PCR仪或平衡至所需温度的水浴中。按下表中方案选其一进行。推荐在PCR仪中进行反应，60°C，15 min。（若选择在37°C水浴反应，请在10 μl反应中加入2 μl Fast-Fusion Enzyme。）反应结束后应立即将反应管置于冰水浴中冷却10 min，然后直接转化。也可选择−20°C储存，待需要时，冰上解冻并转化。
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PCR热循环仪 |
水浴 |
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70°C, 5 min |
60°C, 15 min |
37°C, 15 min |
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4°C, ∞ |
4°C, ∞ |
冰水浴 |
F．转化
推荐使用转化效率≥108 cfu/μg的感受态细胞，按照对应的说明书操作。若转化效率低于108 cfu/μg，可在凃布前将培养的菌液在6000 rpm离心5 min，沉菌用100 μl培养基重悬后，全部涂于对应抗性的平板上。第二天培养后，形成数百个单克隆，可根据需要选择PCR或酶切鉴定是否为阳性。
G．常见问题与解决方案
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问题 |
可能的原因 |
解决方案 |
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平板上无克隆或克隆数目很少 |
引物序列不正确 |
l 确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。 |
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PCR产物不纯 |
l 优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物。 l 换一种纯化方法，纯化您的PCR产物。 |
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反应体系中DNA浓度太低 |
l 在重组反应中，加入推荐的DNA量。 |
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不纯的载体或插入片段抑制重组反应 |
l 推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。 |
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转化过程中加入重组反应液过多 |
l 重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。 |
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感受态细胞转化效率低 |
l 更换新鲜、高效的感受态细胞。 |
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培养基中加入错误或过多抗生素 |
l 在转化平板中加入正确、适量的抗生素。 |
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假阳性克隆数目多 |
克隆载体线性化不完全 |
l 重新酶切您的载体，增加酶切时间，并胶回收纯化。 |
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PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染 |
l 可在PCR反应之前先将模板质粒线性化。 l PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。 |
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转化用平板放置时间过长导致抗性失效 |
l 确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。 |
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克隆含有不正确的插入片段 |
PCR产物混有非特异性片段 |
l 优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段。 |
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